UNA DIAGNOSI AD ALTA TECNOLOGIA PER LE ALLERGIE PIU’ COMUNI
La diagnosi di allergia
L’allergologia è una branca della Medicina che si occupa della prevenzione, della diagnosi e del trattamento delle allergie. Con il termine di allergia si identifica un insieme di patologie caratterizzate da ipersensibilità verso determinate sostanze. All’origine del termine comunemente impiegato, talora con errori interpretativi nel linguaggio comune, ci sono i lavori di C. von Pirquet e B. Schick, all’inizio del XX secolo. In sostanza von Pirquet e Schick osservarono come nel corso della risposta immunitaria si potessero sviluppare risposte “alterate”, dannose, quando veniva inoculato un siero eterologo in un paziente e si praticava la vaccinazione per il vaiolo con finalità di terapia.
La parola allergia ha origine dai vocaboli greco ἄλλος, che vuole dire “altro”, ed ἔργον che significa “lavoro”. Ovviamente molte interpretazioni di quegli anni erano approssimative data la limitazione delle conoscenze e con la parola ipersensibilità si intendeva un raggruppamento eterogeneo delle allergie: si riteneva infatti che un po’ tutte le manifestazioni allergiche fossero riconducibili a una risposta “sbagliata” del sistema immunitario. Con il graduale progredire delle conoscenze su struttura e funzione del sistema immunitario venne in chiara evidenza che vari meccanismi erano implicati nella risposta di tipo allergico. Dobbiamo arrivare ai lavori di P. Gell e R. Coombs, dei primi anni Sessanta del Novecento, perché venisse ben organizzato l’inquadramento dei diversi meccanismi alla base delle immunoreazioni patogene. Venne proposta una classificazione che prevede quattro tipi di reazioni di ipersensibilità, conosciute come immunoreazioni patogene, distinte in quattro raggruppamenti: da I a IV. Con questa classificazione, successivamente ampliata e in parte modificata, il termine “allergia” fu limitato alla sola ipersensibilità di tipo I. Secondo la definizione di von Pirquet, «allergia» significava infatti “reazione modificata” del sistema immunitario, e il termine poteva applicarsi tanto alla malattia da siero classificata poi ipersensibilità di tipo III (mediata da complessi antigene-anticorpo), quanto alla reazione alla tubercolina (classificata come ipersensibilità di tipo IV cellulo-mediata, o ritardata).
Gli anticorpi responsabili delle reazioni allergiche sono le “IgE“ (definite anche “reagine”). Le IgE sono abitualmente presenti in tutti gli individui sani e hanno un ruolo importante nella difesa contro alcuni patogeni, come si verifica per le elmintiasi. Tuttavia nei soggetti geneticamente predisposti all’allergia, per complessi meccanismi di alterata regolazione, la sintesi di IgE nei confronti di alcune sostanze allergizzanti aumenta in modo significativo. Il dosaggio nel sangue si esegue con un test chiamato PRIST (Paper Radio Immuno Sorbent Test). Un livello elevato di IgE nel sangue orienta verso allergia ma può essere trovato anche in soggetti che non sono allergici. Il test fondamentale per la diagnosi di allergia è il test cutaneo “prick-test“. Per eseguire questo test (“in vivo”) si pone una minima quantità di allergene (sostanza verso la quale è possibile che si sia manifestata la reazione allergica) sulla cute lievemente scarificata del soggetto in esame (grazie all’impiego di lancette “calibrate” con una punta molto piccola). Se nel sangue del soggetto allergico sono presenti anticorpi IgE attivi contro un determinato allergene si osserverà una reazione di edema localizzato con prurito (pomfo) in corrispondenza della piccola area cutanea dove è stata posta la sostanza alla quale è allergico (o si suppone sia allergico) il paziente. Un’altra indagine utilizzata è il RAST (Radio Allergo Sorbent Test) che consente di identificare “in vitro” le IgE “specifiche” verso un determinato allergene.
I sintomi dell’allergia di tipo I sono abbastanza facilmente identificabili. L’allergia può interessare tutti, a qualsiasi età e senza differenze di sesso; si manifesta a volte all’apparato gastroenterico con nausea, vomito, diarrea (rara e non necessariamente stagionale), a volte sulla cute, a volte a livello respiratorio. Le manifestazioni più fastidiose e frequenti, ben conosciute dalle persone interessate e dai medici, possono essere riassunte come segue:
• sintomi nasali e respiratori: starnuti frequenti, anche “a raffica”, secrezioni acquose nasali, naso chiuso, prurito. senso di mancanza d’aria, tosse di origine irritativa, respiro affannoso e accorciato;
• sintomi oculari (oculorinite): prurito, arrossamento, gonfiore, lacrimazione, fastidio alla luce (fotofobia);
• sintomi cutanei: prurito, edemi, arrossamenti (orticaria).
I sintomi possono presentarsi con caratteri limitati, possono avere stagionalità (pollinosi, fioritura di piante) o essere associati in modo vario. Una delle complicazioni dell’allergia a livello respiratorio consiste nell’instaurarsi dello stato asmatico, realmente limitativo per la qualità di vita del paziente e talora condizione che può mettere a rischio la vita stessa.
Test per il dosaggio delle IgE su microarray ISAC.
Molte sono le sostanze in grado di provocare allergia e alcune di esse hanno una reattività crociata, condizionando il rischio di manifestazioni cliniche anche gravi e causando obiettive difficoltà diagnostiche. Per ovviare alla difficoltà diagnostica di individuare lo specifico allergene con test in vitro è disponibile in laboratorio un test particolarmente avanzato per identificare le IgE. Il test è noto come ImmunoCAP- ISAC (Phadia, Uppsala – Svezia) e permette la definizione del profilo di sensibilizzazione di ogni singolo soggetto in modo molto dettagliato, non ottenibile con i test cutanei (skin test) o con gli altri di sistemi noti di valutazione delle IgE: per il dosaggio delle IgE con metodo ISAC vengono utilizzate molecole altamente purificate, sia naturali sia ricombinanti.
ImmunoCAP ISAC IgE permette di evidenziare contemporaneamente, partendo da una goccia di siero o plasma del soggetto in esame, la presenza di IgE dirette contro numerosi determinanti allergenici che vengono fissati su una superficie solida precostituita. La metodica, di alto livello tecnologico e già impiegabile nei laboratori più attrezzati, è un nuovo approccio, realmente innovativo, basato sull’impiego di biochip per l’analisi semi-quantitativa delle IgE. Con l’attuale kit si possono valutare fino a 112 componenti allergeniche. In pratica il test consente di effettuare un vero e proprio screening a tutto campo, rapido ed efficace, per la ricerca di anticorpi IgE rivolti verso un’ampia gamma di molecole potenzialmente causa della sensibilizzazione allergica e, dato di grande rilievo clinico, il test permette di riconoscere eventuali allergie dovute a reattività crociate, ovvero presenti verso componenti molecolari che si possono trovare in vari composti, anche molto diversi fra loro (per esempio allergeni alimentari e sostanze allergeniche inalanti).
ImmunoCAP ISAC IgE è un test immunologico in fase solida. Le frazioni molecolari (allergeni) sono fissate in formato microarray su un substrato solido. I “protein microarray” (detti anche biochip, proteinchip) sono utilizzati nelle applicazioni biomediche per determinare la presenza e/o la quantità di proteine in campioni biologici, ad esempio nel sangue. In italiano array può essere semplicemente tradotto con il termine “raggruppamento”. E di un vero e proprio micro-raggruppamento di allergeni si tratta. Le componenti allergeniche, immobilizzate sul substrato solido, vengono incubate con campioni di plasma o siero umano in esame. Il legame tra gli anticorpi IgE specifici e le componenti allergeniche legate alla fase solida, viene rilevato grazie a un anticorpo secondario anti-IgE umane marcato con un composto fluorescente.
Una scansione con un appropriato scanner per microarray consente l’acquisizione delle immagini. Il programma MIA (Phadia – Microarray Image Analysis Software) permette poi l’analisi dei risultati e la determinazione delle ISU (ISAC Standardized Units) per IgE specifiche (ISU). Il sistema ISU può definire, con questo approccio, una valutazione semiquantitativa. Per l’esecuzione del test è sufficiente una quantità minima di plasma (20-30 microlitri). La determinazione semiquantitativa, basata sull fluorescenza, definisce un range di risposta da 0,3 a 100 ISU-E. La procedura completa prevede 4 ore.
Nel panel del microarray si hanno 112 allergeni con la distribuzione riportata nell’immagine Phadia (fig. 1).
La risposta al test in unità ISU-E è semplice e di prima evidenza. Il sistema standardizzato prevede 4 livelli:
•< 0,3: test negativo (non esiste nel sangue esaminato nessuna IgE specifica verso gli allergeni);
•<0,3 – 0,9: positività bassa;
•<1,0 – 14,9: positività moderata-alta;
•≥ 15: positività molto alta.
Per facilitare la lettura viene fornito, nel foglio della risposta, un gradiente cromatico di riferimento vicino a ciascun valore. Questa modalità di rappresentazione permette, a colpo d’occhio, di comprendere il livello di positività (aspetto semiquantitativo) o la negatività della risposta (fig. 2).
Un esempio pratico: profiline e cross-reattività
Le profiline sono proteine molto diffuse in natura e appartengono a strutture allergeniche anche non correlate filogeneticamente. Si trovano sostanzialmente in tutte le cellule nucleate e il loro ruolo consiste nell’agire durante la polimerizzazione di filamenti actinici, elementi essenziali nella struttura del citoscheletro. Data l’importanza funzionale delle profiline le sequenze della struttura primaria sono ben conservate attraverso le specie vegetali anche evoluzionisticamente divergenti, con un 80% di omologia e una sorprendente somiglianza anche nella struttura secondaria e terziaria.
Verso la fine del ventesimo secolo, nei primi anni Novanta, alcuni ricercatori osservarono che le IgE specifiche di soggetti con allergia verso il polline di betulla potevano reagire con la profilina presente in granuli di polline e con reattività crociata con altre profiline distribuite in alimenti di origine vegetale. In questo modo venne chiaramente dimostrato come le profiline potevano essere responsabili delle così dette sensibilizzazioni crociate tra pollini e alimenti di origine vegetale. Viene coniato da questo momento il termine di panallergene. Ora è evidente che la sensibilizzazione verso il panallergene profilina fornisce risultati crociati che rendono difficile, se non impossibile, arrivare a una diagnosi ricorrendo ai soli test cutanei. Sono evidenti le implicazioni pratiche, di natura profilattica e terapeutica. Per esempio l’adozione di un trattamento iposensibilizzante (immunoterapia specifica, il così detto “vaccino”) dovrebbe essere programmato dallo specialista con l’indagine di marker allergenici specifici. Ecco perché un test con ISAC è di grande aiuto: non ha invasività (è sufficiente una quantità minima di prelievo ematico), non risulta condizionato da terapie farmacologiche, è un’indagine ottimale per la ricerca di sensibilizzazione verso allergeni frequenti sia di tipo inalatorio sia alimentare. Poiché, inoltre, vengono utilizzati solo allergeni con struttura molecolare del componente (ricombinanti o antigeni naturali purificati) la specificità è garantita.
Un esempio pratico:
i soggetti che hanno allergia al polline di betulla sono assai spesso allergici ad alimenti che hanno sostanze simili (mele, sedano, carote).
Si ha una vera e propria sensibilizzazione crociata “occulta”, celata fra componenti correlati che però hanno diversa provenienza: questa sensibilizzazione crociata può essere messa in evidenza con un solo passaggio “diagnostico” nel sistema microarray che consente il confronto di numerose molecole nello stesso tempo.
